Summary
With a total volume of only a few per cent of the whole gland the mammalian endocrine pancreas is dispersed in a great number of islets of Langerhans. Studies of this endocrine organ are further complicated by the fact that each islet is composed of cells representing different endocrine functions. The present communication deals with some attempts to overcome these analytical difficulties by the following experimental approaches: A) The observation of a strict balance between the number of large and small islets made it possible to introduce rapid methods for estimation of the total islet volume. It was found necessary merely to count the number of large islets in pancreatic sections taken at regular intervals. There was also a linear relationship between the total islet volume and the number of long islet intercepts obtained by scanning sections with parallel lines. B) Attempts were made to identify the different types of islet cells by restaining thin paraffin sections after initial silver impregnation. Most important for the final success was the elaboration of a technique which gave a consistent argyrophilia in some islet cells, and the observation that these silver deposits could be removed by oxidation in potassium permanganate. It is now well established that the pancreatic islets contain α1, α2 and β-cells as well as some cells which lack discernible granules both in the light and electron microscope. C) Evaluation of how various substances affect insulin release was simplified by the introduction of a system in vitro employing a single islet microdissected from an obese-hyperglycaemic mouse. This technique allowed both a description of insulin release in terms of islet weight, and a correlation of the rate of insulin secretion with other metabolic events in the β-cells. The amount of insulin released during 30 min was found to be about one per thousand of the islet dry weight, or less than one per cent of the β-cell content of insulin. The rate of insulin secretion was significantly enhanced by increasing the movements of the incubation medium by shaking. A water extract of the α1-cells served as an effective inhibitor of insulin release. D) A combined approach in vivo and in vitro was found to provide a useful system for analyzing how the β-cell levels of glycolytic intermediates and cofactors were related to the rate of insulin secretion. After the freeze-dried pancreas sections had been exposed to formaldehyde vapours and refixed in Bouin's solution, the islet cells could be identified by silver impregnation and restaining. The sulphonylurea-stimulation of insulin release was found to be associated with a significant depression of the β-cell content of ATP and glycogen. There was, on the other hand, a striking accumulation of fructose-1.6-diphosphate and other intermediates of glucose above this metabolic stage when insulin secretion was inhibited either by epinephrine or diazoxide or by omission of Ca2+. These data were tentatively interpreted as indicating the existence of a rate limiting step in β-cell glycolysis of direct significance for regulation of insulin release. This control site might be the sequence phosphoglyceraldehyde dehydrogenase-phosphoglycerate kinase.
Résumé
Avec un volume total représentant seulement quelques pour cent de la glande entiere, le pancrèas endocrine des mammifères est dispersé en une grande quantité d'îlots de Langerhans. L'étude de cet organe est en outre compliquée par le fait que chaque îlot est composé de cellules représentant des fonctions endocrines variées. Le présent rapport traite des tentatives effectuées pour résoudre ces difficultés d'analyse en utilisant les méthodes suivantes: A) L'observation d'un équilibre strict entre le nombre d'îlots grands et petits a rendu possible l'introduction de procédés rapides pour l'estimation du volume insulaire total. Nous avons jugé utile de compter seulement le nombre de grands îlots des coupes pancréatiques prises à intervalles réguliers. Il y avait aussi une relation linéaire entre le volume insulaire total et le nombre d'intersections longues des îlots obtenues par exploration des coupes selon des lignes parallèles. B) On a essayé d'identifier les diverses sortes de cellules insulaires, en recolorant de minces coupes de paraffine, après une imprégnation initiale d'argent. Le plus important pour obtenir un résultat valable fut l'élaboration d'une technique produisant une argyrophilie stable dans certaines cellules insulaires et l'observation que ces précipités d'argent pouvaient être supprimés par oxydation au permanganate de potassium. Il est aujourd'hui bien établi, que les îlots de Langerhans contiennent des cellules α1, α2 et β ainsi que certaines cellules sans granules perceptibles même au microscope électronique. C) L'évaluation des effets directs de substances variées sur la libération d'insuline, fut simplifiée par l'introduction d'un système in vitro, se servant d'un seul îlot microdisséqué d'une souris obèse-hyperglycémique. Cette technique a permis non seulement une description de la libération d'insuline en fonction du poids insulaire, mais encore une corrélation entre l'insulino-sécrétion et d'autres événements métaboliques dans les cellules β. La quantité d'insuline sécrétée pendant 30 min se trouvait être approximativement un pour mille du poids sec des îlots ou moins d'un pour cent du contenu d'insuline de la cellule β. La vitesse de l'insulino-sécrétion fut significativement augmentée par agitation du milieu d'incubation. Un extrait aqueux des cellules α1 a servi d'inhibiteur effectif pour la libération d'insuline. D) Une tentavive d'analyse à la fois in vivo et in vitro s'est avérée représenter une méthode propre à déterminer la corrélation entre les taux bêta-cellulaires des intermédiaires de la glycolyse et des co-facteurs et la vitesse de la sécrétion insulinique. Après avoir exposé les coupes pancréatiques aux vapeurs d'aldéhyde formique, on les a reflxées dans une solution de Bouin. Puis les cellules insulaires pouvaient être identifiées à l'aide d'imprégnation d'argent et de recoloration. La stimulation de la libération d'insuline par les sulfonylurées, était accompagnée d'un abaissement significatif du contenu en ATP et en glycogène de la cellule β. On a trouvé, d'autre part, une accumulation frappante de fructose-1.6-diphosphate et d'autres intermédiaires du glucose avant cette étape métabolique pendant une inhibition de la sécrétion insulinique par l'adrénaline ou le diazoxide ou par l'omission de Ca2+. Les données présentes furent interprétées comme l'annonce de l'existence d'un point contrôlant la glycolyse de la cellule β et en même temps dirigeant la libération d'insuline. Ce point de contrôle pourrait être la séquence de la phosphoglycéral-déhyde déshydrogénase-phosphoglycérate kinase.
Zusammenfassung
Mit einem Gesamtvolumen von nur wenigen Prozenten der ganzen Drüse ist das endokrine Pankreas der Säugetiere auf zahlreiche Langerhans'sche Inseln verteilt. Das Studium dieses endokrinen Organs wird weiter dadurch kompliziert, daß die einzelne Insel aus Zellen besteht, die verschiedene endokrine Funktionstypen aufweisen. In der vorliegenden übersicht werden einige Auswege beschrieben, wie die überwindung dieser analytischen Probleme zu erzielen ist. A) Die Feststellung einer engen Beziehung zwischen der Anzahl gro\er und kleiner Inseln hat es ermöglicht, einfache Methoden für das Messen des totalen Inselvolumens zu entwickeln. Man nimmt die Pankreasschnitte mit gleichen Intervallen und zählt nur die gröβeren Inseln. Eine lineare Beziehung konnte nachgewiesen werden zwischen dem Gesamtvolumen der Inseln und der Anzahl länglicher Inselstreifen, die man durch „scanning” mit parallelen Linien erhält. B) Mit Hilfe von Silberimprägnierung und darauf folgender Granulafärbung dünner Paraffinschnitte wurde versucht, die verschiedenen Typen von Inselzellen zu identifizieren. Für den Erfolg entscheidend war einerseits die Entwicklung einer Methode, die in einigen Zellen eine konsistente Argyrophilie ergab, und anderseits die Beobachtung, daß sich diese Silberpräzipitate durch Oxydation mit Kaliumpermanganat entfernen lieβen. Es ist heute gesichert, daß die Langerhans'schen Inseln α1, α2 und β-Zellen enthalten und außerdem noch einige Zellen, die weder im Lichtmikroskop noch im Elektronen-mikroskop erkennbare Granula aufweisen. C) Der Einfluß verschiedener Substanzen auf die Insulinfreisetzung wurde unter Verwendung einzelner mikrodissezierter Inseln von obese-hyperglykämischen Mäusen gemessen. Diese in vitro Technik hat nicht nur eine Beschreibung der Insulinsekretion im Verhältnis zum Inselgewicht erlaubt, sondern auch eine Korrelation zwischen der Insulinsekretion und anderen metabolischen Abläufen in den β-Zellen. Das nach 30 min freigesetzte Insulin machte ungefähr ein Promille des Trockengewichts der Insel aus oder weniger als ein Prozent des Insulingehaltes der β-Zelle. Die Insulinsekretion wurde durch Schütteln des Inkubationsmediums erheblich gesteigert. Ein wässeriger Extrakt von α1-Zellen diente als effektiver Hemmstoff im Hinblick auf die Freisetzung von Insulin. D) Eine kombinierte in vivo und in vitro Technik hat es ermöglicht, eine Beziehung zwischen glykolytischen Metaboliten in den β-Zellen und der Insulinfreisetzung festzustellen. Die gefriergetrockneten Pankreasschnitte wurden mit Formaldehydgasen behandelt und in Bouins Lösung nachfixiert, um die Inselzellen durch Silberimprägnierung und darauf folgende Granulafärbung identifizieren zu können. Die Stimulierung der Insulinfreisetzung mit Sulfonylharn-stoffen war in den β-Zellen mit einer Verminderung des Gehaltes an ATP und Glykogen verbunden. Eine auffallende Anhäufung von Fructose-1.6-diphosphat und anderen glykolytischen Zwischenprodukten oberhalb dieser metabolischen Stufe wurde nachgewiesen, wenn die Insulinfreisetzung entweder durch Adrenalin oder Diazoxid oder nach Ausschaltung von Ca2+ gehemmt worden war. Unsere Resultate deuten auf das Vorhandensein eines limitierenden Schrittes hin, der nicht nur für den Glucoseabbau, sondern auch für die Regulation der Insulinsekretion bedeutungsvoll ist. Dieser Kontrollpunkt könnte mit der Reaktionsfolge: Phosphoglycerinaldehyd-Dehydrogenase und Phosphoglycerat-Kinase identisch sein.
Article PDF
Similar content being viewed by others
References
Björkman, N., Hellerström, C., Hellman, B., Petersson, B.: The cell types in the endocrine pancreas of the human fetus. Z. Zellforsch. 72, 425–445 (1966).
Boquist, L.: Morphology of the pancreatic islets of the non-diabetic adult Chinese hamster Cricetulus griseus. Acta Soc. Med. upsalien. 72, 331–344 (1967).
Bouman, P.R.: Release of insulin from isolated rat pancreas in vitro. Acta endocr. (Kbh.) 35, 560–567 (1960).
Brolin, S., Hellman, B.: New methods for determination of the pancreatic islet volume. Diabetes 12, 62–65 (1963).
Coore, H.G., Rändle, P.J.: Regulation of insulin secretion studied with pieces of rabbit pancreas incubated in vitro. Biochem. J. 93, 66–78 (1964).
De Beer, L., De Schepper, P.J.: Metabolic effects cf hypoglycemic sulfonylureas. In vitro effect of sulfonylureas on cell-free protein synthesis and energy metabolism in rat tissues. Biochem. Pharmacol. 16, 2355–2367 (1967).
Falkmer, S., Hellman, B., Voigt, G.E.: On the agranular cells in the pancreatic islet tissue of the marine teleost Cottus scorpius. Acta path, microbiol. scand. 60, 47–54 (1964).
Foa, P.P.: Glucagon. Ergebn. Physiol. 60, 142–219 (1968).
Gomori, G.: Observations with differential stains on human islets of Langerhans. Amer. J. Path. 17, 395–406 (1941).
—: Aldehyde-fuchsin: A new stain for elastic tissue. Amer. J. clin. Path. 20, 665–666 (1950).
Grimelius, L.: A silver nitrate stain for α2 cells in human pancreatic islets. Acta Soc. Med. upsalien. 73, 243–270 (1968).
Hales, C.N., Randle, P.J.: Immunoassay of insulin with insulin-antibody precipitate. Biochem. J. 88, 137–146 (1963).
Hellerström, C.: The influence of pregnancy and lactation on the endocrine pancreas of mice. Aeta Soc. Med. upsalien. 68, 17–28 (1963).
—: A method for the microdissection of intact pancreatic islets of mammals. Acta endocr. (Kbh.) 45, 122–131 (1964).
—: Effects of carbohydrates on the oxygen consumption of isolated pancreatic islets of mice. Endocrinology 81, 105–112 (1967).
— Hellman, B.: Some aspects of silver impregnation of the islets of Langerhans in the rat. Acta endocr. (Kbh.) 35, 518–532 (1960).
— —: The islets of Langerhans in yellow obese mice. Metabolism 12, 527–536 (1963).
— —: Petersson, B., Alm, G.: The two types of pancreatic A-cells and their relation to the glucagon secretion. In: The Structure and Metabolism of the Pancreatic Islets I, pp. 117–130. Eds. Brolin, S.E., Hellman, B., Knutson, H. Oxford: Pergamon Press 1964.
Hellman, B.: The volumetric distribution of the pancreatic islet tissue in young and old rats. Acta endocr. (Kbh.) 31, 91–106 (1959a).
—: The frequency distribution of the number and volume of the islets of Langerhans in man. 1. Studies on non-diabetic adults. Acta Soc. Med. upsalien. 64, 432–460 (1959b).
—: Actual distribution of the number and volume of the islets of Langerhans in different size classes in non-diabetic humans of varying ages. Nature (Lond.) 184, 1498–1499 (1959c).
—: A method for rapid estimation of the islet volume in the rat pancreas based on counting instead of measuring the islet section surfaces. Acta path, microbiol. scand. 47, 21–34 (1959d).
—: Studies in obese-hyperglycemic mice. Ann. N. Y. Acad. Sci. 131, 541–558 (1965).
—: Histochemical observations of the β-cells during insulin secretion. Acta Diab. Latina 5 (suppl. 1), 446–457 (1968).
—: Brolin, S., Hellerström, C., Hellman, K.: The distribution pattern of the pancreatic islet volume in normal and hyperglycemic mice. Acta endocr. (Kbh.) 36, 609–616 (1961).
—, Hellerström, C.: The islets of Langerhans in ducks and chickens with special reference to the argyrophil reaction. Z. Zellforsch. 52, 278–290 (1960).
— —: The specificity of the argyrophil reaction in the islets of Langerhans in man. Acta endocr. (Kbh.) 36, 22–30 (1961).
— —: Histology and histophysiology of the islets of Langerhans in man. In: Handbuch des Diabetes Mellitus, pp. 89–118. Ed. Pfeiffer, E.F. München: J.F. Lehmanns 1968.
—, Idahl, L.Å.: Control of ATP levels in stimulated pancreatic β-cells. Acta Diab. Latina 6 (suppl. 1), 597–611 (1969).
— —, Danielsson, Å.: Adenosine triphosphate levels of mammalian pancreatic β-cells after stimulation with glucose and hypoglycemic sulfonylureas. Diabetes 18, 509–516 (1969a).
— —, Tjälve, H., Danielsson, Å., Lernmark, Å.: Beobachtungen zum Wirkungsmechanismus des hypoglykämisch wirksamen Sulfonylharnstoff-Präparates HB 419. Arzneimittel-Forsch. 19, 1472–1476 (1969b).
—, Lernmark, Å.: Inhibition of the in vitro secretion of insulin by an extract of pancreatic α1-cells. Endocrinology 84, 1484–1488 (1969a).
— —: A possible role of the pancreatic α1 and α2-cells as local regulators of insulin secretion. In: The Structure and Metabolism of the Pancreatic Islets II. Eds. Falkmer, S., Hellman, B., Täljedal, I.B. Oxford: Pergamon Press (In press) 1969b.
Keen, H., Sells, R., Jarrett, R.J.: A method for the study of the metabolism of isolated mammalian islets of Langerhans and some preliminary results. Diabetologia 1, 28–32 (1965).
Lacy, P.E., Kostianovsky, M.: Method for the isolation of intact islet of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes 16, 35–39 (1967).
—, Young, D.A., Fink, C.J.: Studies on insulin secretion in vitro from isolated islets of the rat pancreas. Endocrinology 83, 1155–1161 (1968).
Lernmark, Å., Hellman, B.: The β-cell capacity for insulin secretion in microdissected pancreatic islets from obese-hyperglycemic mice. Life Sci. (Part II) 8, 53–59 (1969).
Lomsky, R., Langr, F., Vortel, V.: Immunohistochemical demonstration of gastrin in mammalian islets of Langer hans. Nature (Lond.) 223, 618–619 (1966).
Lowry, O.H.: Microanalysis for histochemical purposes. In: Second International Congress of Histo- and Cytochemistry, pp. 62–69. Eds. Schiebler, T.H., Pearse, A.G.E., Wolff, H.H. Berlin: Springer 1964.
—, Passonneau, J.V., Schulz, D.W., Rock, M.K.: The measurement of pyridine nucleotides by enzymatic cycling. J. biol. Chem. 236, 2746–2755 (1961).
Lundquist, G., Brolin, S.E., Unger, R.H., Eisentraut, A.: The cellular origin of glucagon. In: The Structure and Metabolism of the Pancreatic Islets II. Eds. Falkmer, S., Hellman, B., Täljedal, I.B. Oxford: Pergamon Press (In press) 1969.
Mahler, H.R., Cordes, E.H.: Biological Chemistry. New York: Harper & Ron 1966.
Malaisse, W., Malaisse-Lagae, F., Wright, P.H.: A new method for the measurement in vitro of pancreatic insulin secretion. Endocrinology 80, 99–108 (1967).
Matschinsky, E.M., Passonneau, J.V., Lowry, O.H.: Quantitative histochemical analysis of glycolytic intermediates and cofactors with an oil well technique. J. Histochem. Cytochem. 16, 29–39 (1968).
Mering, J., von, Minkowski, O.: Diabetes mellitus nach Pankreasextirpation. Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak. 26, 371–387 (1889).
Mialhe, P., Meyer, V.: Sécrétion d'insuline par le pancréas de rat in vitro. C.R. Acad. Sci. (Paris) 253, 1861–1863 (1963).
Milner, R.D.G., Hales, C.N.: Ionic mechanisms in the regulation of insulin secretion. In: The Structure and Metabolism of the Pancreatic Islets II. Eds. Falkmer, S., Hellman, B., Täljedal, I.B. Oxford: Pergamon Press (In press) 1969.
Minkowski, O.: Untersuchungen über den Diabetes Mellitus nach Extirpation des Pankreas. Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak. 31, 85–189 (1893).
Moskalewski, S.: Isolation and culture of the islets of Langerhans of the guinea pig. Gen. comp. Endocr. 5, 342–353 (1965).
Parker, J.C., Hoffman, J.F.: The role of membrane phosphoglycerate kinase in the control of glycolytic rate by active cation transport in human red blood cells. J. gen. Physiol. 50, 893–916 (1967).
Pentillä, L.M.: Effect of insulin, chlorpropamide and tolbutamide on the metabolism of branched chain amino acids. Ann. Med. exp. Fenn. 44, suppl. 11 (1966).
Petersson, B., Hellman, B.: The pancreatic islet tissue in mice with obesity by goldthioglucose. Acta path. microbiol. scand. 55 401–406 (1962a).
— —: Long-term effects of restricted caloric intake on pancreatic islet tissue in obese-hyperglycemic mice. Metabolism 11, 342–348 (1962b).
— —: Effects of long term administration of glueagon on the pancreatic islet tissue of rats and guinea pigs. Acta endocr. (Kbh.) 44, 139–149 (1963).
Samols, E., Tyler, J.M., Mialhe, P.: Suppression of pancreatic glueagon release by the hypoglycemic sulfonylureas. Lancet 1969 I, 174–176.
Scrutton, M.C., Utter, M.F.: The regulation of glycolysis and glucogenesis in animal tissues. Ann. Rev. Biochem. 37, 249–302 (1968).
Stauffacher, W., Lambert, A.E., Vecchio, D., Renold, A.B.: Measurements of insulin activities in pancreas and serum of mice with spontaneous (“obese” and “New Zealand obese”) and induced (goldthioglucose) obesity and hyperglycaemia, with considerations on the pathogenesis of the spontaneous syndrome. Diabetologia 3, 230–237 (1967).
Stork, H., Schmidt, F.H., Westman, S., Hellerström, C.: Action of some hypoglycaemic sulphonylureas on the oxygen consumption of isolated pancreatic islets of mice. Diabetologia 5, 279–283 (1969).
Tejning, S.: Dietary factors and quantitative morphology of the islets of Langerhans. Acta med. scand. suppl. 198 (1947).
Tove, P.A., Brolin, S., Hellman, B.: Scanning microscope for photoelectric data evaluation. Rev. Sci. Instrum. 32, 1343–1346 (1961).
Turtle, J.R., Kipnis, D.M.: An adrenergic receptor mechanism for the control of cyclic 3′5′ adenosine monophosphate synthesis in tissues. Biochem. biophys. Res. Comm. 28, 797–802 (1967).
Velic, S.F., Furfine, C.: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. In: The Enzymes, 7, pp. 243–273. Eds. Boyer, P.D., Lardy, H., Myrbäck, K. New York: Academic Press 1963.
Westman, S.: The endocrine pancreas of old obese-hyperglycemic mice. Acta Soc. Med. upsalien. 73, 81–89 (1968).
Author information
Authors and Affiliations
Additional information
The author gratefully acknowledges the privilege of many years of stimulating collaboration with the senior members of the diabetes research group in Uppsala (Drs. Brolin, Hellerström, Petersson and Westman) and Umea (Drs. Danielsson, Falkmer, Idahl, Lernmark and Täljedal). Financial support from the Swedish Medical Research Council (12x-562) and the United States Public Health Service (AM-05759 and AM-12535) has been of the utmost importance in making possible the studies reported in the present lecture.
Rights and permissions
About this article
Cite this article
Hellman, B. Methodological approaches to studies on the pancreatic islets. Diabetologia 6, 110–120 (1970). https://doi.org/10.1007/BF00421438
Received:
Issue Date:
DOI: https://doi.org/10.1007/BF00421438